在咸豐皇帝去世以後，奕便和慈禧慈安兩宮太后聯合起來，結成了同盟，共同對付以肅順為首的「顧命八大臣」。這次政變史稱辛酉政變(又稱北京政變)，奕和兩宮聯手，一舉擊潰了肅順等人的勢力。兩宮太后獲得了「垂簾聽政」的權力;奕被封為議政王，出任軍機揆首，監管總理各國事物衙門，以及擔任宗人府宗令、總管內務府大臣、領神機營、稽查弘德殿一切事物等要職。
辛酉政變後，慈禧意欲獨攬朝政，而奕沒有把深宮中的兩個嫂子---兩個女人，放在眼裡，想「挾天子以令諸侯」。此時，宮中呈現出了兩雄並立之勢，在權力慾的誘惑下「同盟」已經出現了裂痕。
奕自從掌握軍政大權以後，一面不斷取媚於外夷，一面全力圍攻太平天國的起義軍，終於攻陷天京，將一場轟轟烈烈的農民起義鎮壓了下去。奕「安外攘內」的策略讓軍機處的人對他都很恭維，洋人對他也很賞識，他在得意中也不再把慈禧這個「女流之輩」放在眼裡。
愛新覺羅·奕訢而慈禧是個權力慾極強的女人，她絕不會容忍奕獨攬大權，奕越是成功，她就越是記恨，終於產生了要剪除奕的決心。而此時的奕並沒有感到危險，他在得意之時的言談舉止，任人行事未免粗疏而授人以把柄。
同治四年(1865年)，慈禧終於等來了奕出錯的時機。不過，這一次並非奕出錯，而是本非安分之徒的新復翰林院編修署日講官蔡壽祺看準了奕，慈禧矛盾日漸尖銳，頗有幾分以頭顱為賭注的政治流氓氣味，切中慈禧而上奏參劾奕。這一參劾，觸發了慈禧與奕圍繞權利分配的宮廷鬥爭。蔡壽祺的參劾共八條，列舉了奕貪墨、驕縱、攬權、徇私四大罪狀。但是，蔡壽祺所列舉奕的四大罪狀均無實際根據可查，全是由「疑慮」、「猜疑」、「疑惑」而頂，卻又極富煽動性。所以，蔡壽祺的奏折一上，兩宮震怒，諸臣惶惶，奕雖氣憤而不知所措。
關於蔡壽祺參劾奕一案，在李慈銘的《越縵堂日記》。王闓運的《祺祥故事》都有生動的描述。而李慈銘，王闓運二人皆為當時權貴的座上客，故其記載應該是比較真實，絕非一般野史那樣的捕風捉影。據《越縵堂日記》記載：
傳是日王(即議政王奕)進見，太后謂王曰：「有人劾汝！」示以折。王不謝，固問：「何人？」慈禧言：「蔡壽祺。」王失聲曰：「蔡壽祺非好人！」欲逮問之。兩宮怒甚，即召見大學士周培祖、瑞常、吏部尚書朱風標、戶部侍郎吳廷棟、刑部侍郎王發桂、內閣學士桑春榮、殷兆鋪等，垂淚諭臣曰：「王植黨擅政，漸不能堪，欲重治王罪！」
慈禧利用蔡壽祺這一參劾，假小皇帝之名，親書諭旨，著革去奕一切差使，並善後安排諸大臣和親、郡王替代奕諸職。於此，可見慈禧欲打擊奕之決心和手段。
但是，奕也決非一下子就可能打倒的。慈禧假皇帝名義的諭旨頒發後，惇親王奕惇立即進折為奕申辯，五天後又有醇親王奕譞上折為恭親王請命;通政使王拯、御史孫異謀亦各具折，均請「酌賞錄用，以觀後效」。此後，諸親王、大臣亦紛紛上疏，朝廷輿論一時間指皆斥蔡壽祺而傾向奕盉。慈禧眼見事態急轉直下，欲重治奕根本不可能，不得不偃旗息鼓，收兵作罷。於是，奕復被錄用，只是被撤去了議政王銜;奕於兩宮召見時亦假惺惺地灑下了一把辛酸淚。至此，紫禁城內持續了39天之久的一場政治風波始告平息。
此次奕與慈禧的權力之爭，就奕而言，是極盡全力應付了一場突然襲擊;而慈禧的行事又未免草率荒唐。慈禧實在是低估了奕的實力及其影響;奕畢竟是小皇帝載淳的堂堂皇叔，參與朝政多年，於朝野上下樹老根深，黨羽眾多，又建有匡扶社稷之功，且有外國侵略勢力做靠山，絕非旦夕可以動搖者。所以，任憑慈禧的「殺手鑭」威力再大，也不可能輕易就將奕打倒。
奕和慈禧的這番權力較量，畢竟還是以慈禧的小勝而告結束的。奕被免去了議政王銜，促使他認識到不可太為張揚，因而此後也有所收斂;他還認識到只可與慈禧較量而不可觸怒慈安，否則會造成兩宮合力同心之險局。此後，奕在保全自己的前提下，亦不忘伺機反擊，同治八年誅殺慈禧寵信太監安德海，即是奕吸取此次教訓，利用慈安而達到目的的。
在此之後，雖然慈禧始終把加強個人的獨裁權力放在第一位，而奕也並未伏首甘伏，雙方的權力之爭波瀾起伏，幾起幾落，一直持續了近二十年。慈禧一直在尋找狠狠打擊奕的新的時機。光緒十年(1884年)，機會終於來了。這一年，法國入侵越南，把中國在越南的軍隊趕了出來，並把戰火燒到了中越邊界，中法之間已不可避免地將要發生戰爭。慈禧立即抓住這一時機，假公事而洩私憤，以奕辦事循舊、固執己見為由，徹底罷免了他，並且改組軍機處。至此，慈禧的統治地位大大鞏固。雖然是兩宮太后垂簾聽政，但慈安太后無意政事，慈禧便開始長達半個世紀的執政。