從萬曆年間開始，西學開始在士大夫之間流行。在西學東漸的過程中，意大利傳教士利瑪竇功不可沒。
利瑪竇（1552～1610年）生於意大利馬爾凱州的馬切拉塔，原名中文直譯為瑪提歐·利奇，利瑪竇是他的中文名字，他十歲進入家鄉的耶穌會寄宿學校，七年之後被父親送到羅馬，在聖湯多雷亞學院預科學習法律。父親原本希望利瑪竇能在法律方面學有所成，可是利瑪竇違背了父親的願望，他在學習了三年的法律之後，開始在耶穌會主辦的羅馬學院學習人文和科學，並向數學家克拉烏學習天算。在這一時期，利瑪竇還學會了拉丁語和希臘語，並且能夠運用葡萄牙語和西班牙語。
利瑪竇二十六歲時就獲准赴遠東傳教了。第二年春末，利瑪竇來到了西班牙的里斯本，在里斯本科英布拉的寄宿學校等待前往印度的船隻。次年三月，利瑪竇與另外十四名耶穌會傳教士一起乘船從里斯本出發，繞過好望角，途經莫桑比克，歷經艱辛，終於在九月抵達亞洲最重要的殖民地——印度果阿。利瑪竇到達果阿之後，一邊傳教一邊繼續學習神學。在印度傳教遠遠不像利瑪竇想像的那麼容易，好在耶穌會在日本的傳教還比較順利，這給了利瑪竇以鼓舞。在印度的四年裡，利瑪竇還學習了人文學科，並認識到應該允許印度人也學習哲學、教理和神學等歐洲文化，還把這一想法傳達給了耶穌會總部。
當時，擔任耶穌會東方總巡察使的是范禮安，他主要負責向中國派遣基督教傳教士。可是，由於明朝實行了閉關鎖國的政策，所以之前的傳教士們都只能停留在澳門地區，而不能進入中國內地傳教。萬曆八年（1580年），利瑪竇被神父羅明堅舉薦給了范禮安，並被授予神職。萬曆十年八月，利瑪竇應召到達距家數萬里的澳門，開始了與羅明堅一起進入中國內地傳教的嘗試。
傳教士們想通過漢語著述天主教義來「捕捉中國人的心靈」，因此他們在到達澳門之後都努力學習漢語。利瑪竇也不例外，他剛開始學習漢語時，覺得漢字非常不可思議，並對它產生了濃厚的興趣。在此期間，利瑪竇碰巧遇到了日本的天正遣歐使節團，於是順便學習了一點兒日語。
萬曆十二年（1584年），利瑪竇與羅明堅在廣東肇慶建立了第一個傳教駐地。他們初來時，並不敢直言是來傳教的，而是自稱來自天竺，因為仰慕中國才決定終老於此。為了博得中國官員的信任，神父們把主要精力都放在了學習漢語和中國的禮儀習俗上，行事十分小心。為了博得人們的好感，神父們還打扮得像是佛教僧侶。因此，中國人都以為他們是遠道而來的佛教徒，只是長相與之前所見的僧人略有不同而已，所以沒有驅趕他們離開。
利瑪竇是有備而來的，他從西方帶來了許多傳教用的東西：聖母像、地圖、三稜鏡、歐幾里德的《幾何原本》……這些新事物吸引了許多中國人的眼球，尤其是利瑪竇製作並印行的首張中文世界地圖《山海輿地全圖》，它使中國人第一次接觸近代地理學知識，開闊了中國人的眼界。利瑪竇一邊給中國人講解地圖，一邊介紹他們的宗教信仰。利瑪竇還高度讚揚了中國文明，說「中國其實就是一個世界」；還說中國人對醫學、自然科學、數學和天文學都非常精通。利瑪竇同時認為在中國傳教的可能還是很大的，因此，利瑪竇更加堅定了傳教的決心。
為了傳教，利瑪竇還在肇慶建立了「仙花寺」，引得包括士人、僧人在內的許多中國人前來跪拜，所以神父們都非常高興。不過，這些中國人前來跪拜只是出於禮節而已，並沒有其他意義。接著，神父們又翻譯了《主的祈禱》和《聖母讚歌》等宗教小冊子，然後向中國人傳播。總之，利瑪竇利用解釋各種西方事物的機會傳播了他們的宗教信仰，使得中國人開始對基督教有了興趣。於是，羅明堅用拉丁文撰寫了《天主實錄》，然後由利瑪竇和一名中國秀才一起將其翻譯成中文，以解釋天主教的教義。《天主實錄》是西方人用漢語書寫的第一部天主教神學著作，它將天主教教義和儒家思想匯合在一起，比較容易被中國的士大夫階層所接受，它也確實引起了許多中國人的興趣。
經過幾次嘗試，利瑪竇和羅明堅都沒能建立起第二個傳教駐地。不久，羅明堅被教皇召回羅馬另有安排，利瑪竇和另外一名神父麥安東繼續留在肇慶主持傳教工作。
萬曆十七年（1589年）夏，廣東新任總督將利瑪竇所住的西式建築據為己有，並把傳教士們都驅逐出了肇慶，利瑪竇只得移居韶州。在韶州期間，利瑪竇一行先是遇上了強盜打劫，然後是利瑪竇的兩名部下相繼去世。萬曆二十五年，麥安東神父也去世。兩年之後，利瑪竇一行就只剩下他一個人了。幸好利瑪竇在肇慶結識了一位士人，這位士人名叫瞿太素，他與利瑪竇既是好友又是師徒，他不但幫助利瑪竇翻譯了歐幾里得《幾何原本》的第一卷，還向高官們宣傳了利瑪竇自製的天體儀、地球儀和計時用的日晷等西洋物品。因此，當地的達官貴人逐漸熟悉了利瑪竇，還邀請利瑪竇前去做客。通過與中國許多上流社會人士的接觸，利瑪竇發現當時的中國人並不尊重僧人，於是他在徵得范禮安的同意之後留起鬍子，打扮成了儒士的模樣，以便與中國官員交往。經過多方努力，利瑪竇在韶州建立了第二個傳教駐地。
利瑪竇在韶州期間還攻讀了《四書》，並將其譯為拉丁文，這是第一次有人將《四書》翻譯為拉丁文。
萬曆二十二年（1594年），利瑪竇嘗試跟隨將要去援朝抗日的中國官員石星進入北京。可是，在到達南京時，事態有變，所以利瑪竇就身不由己地來到了南昌，並獲得在南昌居住的許可。在南昌期間，利瑪竇結識了江西巡撫陸萬垓，向他展示了三稜鏡、鐘錶和西國記憶法，還介紹了一些西方書籍。之後，利瑪竇又向當地的學子講起了數學、日晷記時等問題，還成功預測了一次日食。因此，利瑪竇很快就成了當地的知名人物，並結交了當地的許多儒士、權貴，還受當時的名士章潢之邀去白鹿洞書院講學。利瑪竇帶來的地球儀、玻璃器皿、西式裝訂書籍等禮物，引起了王室成員以及各級官員的興趣。於是，利瑪竇就在自己的住處舉行了「科普」展覽，還向人們展示了他超強的記憶方法……
利瑪竇在中國生活了十二年之後，深知書籍在中國的作用遠遠勝於言語，因此，他在南昌建立了新的傳教駐地，然後出版了他的第一部中文作品《交友論》。《交友論》主要收集了亞里士多德、普魯塔克、西塞羅等西方著名哲學家的交友格言，利瑪竇為了適應中國文人的情感對某些方面進行了修改，然後編成一個集子，還為它作序並出版，再作為禮物送給王室成員，引起了人們的興趣。友誼被孔子認為是天下五倫之一，利瑪竇選擇以友誼為主題的格言，表現了他抓住了中國文化的精髓。利瑪竇明白，基督教必須表明自己與中國的社會秩序是統一的，才能被中國人接受。利瑪竇的付出沒有付之東流，《交友論》深得當時士大夫的讚賞。
除了《交友論》之外，利瑪竇還選擇了適合中國人倫理觀的西方偉人語錄加以刊行。他放棄了建造教堂、公開傳教的方法，通過用「天主」偷換了中國自古就有的「上帝」概念，逐步探索並實踐了他的傳教策略，最終形成了一套成功的傳教策略。在南昌，利瑪竇建立了第三個傳教駐地。
萬曆二十五年（1597年），利瑪竇被任命為負責中國傳教的主管，於是他開始策劃去北京傳教。次年，利瑪竇設法與禮部尚書王忠銘一起到達北京，但是由於戰爭被迫離開。萬曆二十七年，利瑪竇定居在南京，並建立了第四個傳教駐地。利瑪竇在南京居住期間，通過瞿太素結交了李贄、徐光啟等名士，還與一位和尚展開了一場辯論，並憑借其科學性的思辨佔了上風。接著，他在南京建立了第四個傳教駐地，大力開展傳教活動，使得南京成為中國天主教史上最重要的傳教中心之一。
在南京待了一年，利瑪竇就帶著準備獻給皇帝的禮物開始了北京之行。萬曆二十九年（1601年）初，利瑪竇抵達北京，向萬曆皇帝進獻了自鳴鐘、聖經、《萬國圖志》、大西洋琴等西方物品。萬曆皇帝非常喜歡，下詔允許利瑪竇等人長期居住在北京。
利瑪竇在北京期間，以豐富的中西方知識結交了中國的許多士大夫。他經常與賓客們談論靈魂、天堂和地獄等，並用中文編撰了《二十五言》、《天主實義》等新書，得到了許多士大夫的敬重。到萬曆三十三年時，北京信奉天主教的中國人已達二百人，其中包括進士出身的徐光啟等朝廷大臣。
利瑪竇在進行傳教活動的同時，也為中西方的文化交流做出了很大的貢獻。萬曆三十五年（1607年），利瑪竇與徐光啟合作翻譯並出版了歐幾里德《幾何原本》的前六卷，該譯本首次把歐幾里德幾何學及其嚴密的邏輯體系和推理方法引入中國，同時確定了點、直線、平行等許多我們現在耳熟能詳的幾何學名詞。萬曆三十八年五月（1610年），利瑪竇病逝於北京，首次獲明朝皇帝批准在中國安葬，就像他當初所說的那樣終老於中國了。