1856年6月過後，太平天國的力量空前強大，其內部隱藏的危機也開始蠢蠢欲動。此時，「永安建制」分封的五王之中有兩王已經戰死，餘下的三王尤以東王楊秀清的權力最大。東王本就有節制其餘四王的權力，再加上南王和西王已死，楊秀清的權力就更加膨脹了，就連天王洪秀全都要受他鉗制。實際上，洪秀全雖然貴為天王，但在太平天國運動前期並未掌握實權。
這段時期，楊秀清經常自稱被下凡的天父附體，乘機要挾洪秀全聽從自己的命令。有一次，楊秀清故技重施，又稱天父附到了自己身上，叫洪秀全速到東王府來。洪秀全過來以後，楊秀清便假借天父的名義向他提出了質疑：為什麼為太平天國立下汗馬功勞的東王卻不能被稱為萬歲？洪秀全只好表示，東王絕對有被稱為萬歲的資格。
在此期間，北王韋昌輝和翼王石達開的親友都曾因犯錯而遭到楊秀清的嚴懲。韋昌輝和石達開雖然表面上不敢說什麼，但私底下都對楊秀清十分不滿。韋昌輝甚至懇請洪秀全將楊秀清處死，結果遭到了洪秀全的拒絕。當時洪秀全尚未對楊秀清動殺機，不過卻已對其產生了深深的芥蒂。
其後，楊秀清又借口前線戰事緊急，將韋昌輝和石達開都調離了天京。這樣一來，天京就只剩下了洪秀全和楊秀清兩人主持大局。這段時期，太平軍中的將領陳承瑢開始在兩人之間挑撥離間，因為這兩人都非常信任陳承瑢，所以當陳承瑢向洪秀全告密說楊秀清密謀殺死天王取而代之時，洪秀全馬上就對這個消息給予了高度的重視。
洪秀全向韋昌輝、石達開和秦日綱發出了密令，要求他們帶兵趕回天京城，突襲東王府，將楊秀清誅殺。陳承瑢主動擔當內應，迎接韋昌輝及其率領的三千名太平軍入城。楊秀清被誅殺後，他的家眷、僕人也受到牽累，被韋昌輝、秦日綱和陳承鎔率領的太平軍殺得一乾二淨。不僅如此，韋昌輝還藉著清除東王黨羽的名義，在天京城內大開殺戒，總共有兩萬多人被殺，其中絕大多數都是無辜的將士甚至是平民百姓。
石達開回城之後，對韋昌輝濫殺無辜一事極為不滿，並與之發生了衝突。韋昌輝一怒之下，居然又對石達開的家眷和部下大開殺戒。石達開在夜色的掩護下逃到了天京城外，但留在天京翼王府中其他人卻被韋昌輝殺了個精光。
石達開在極度的悲憤之下上書天王，請求誅殺北王以平民憤。與此同時，石達開還組織天京城外的太平軍在安徽安慶向韋昌輝開戰。韋昌輝此刻已是人心盡失，索性領兵對天王府發起了進攻。很快，韋昌輝就兵敗被殺，秦日綱和陳承瑢也被洪秀全下令處死。這就是天京事變的始末。
天京事變是天平天國由盛轉衰的分界點，儘管此次事變最終平息下來了，但太平軍中很多將士卻因此變得心灰意冷。天京事變過後，「永安建制」分封的五王已經死去大半，翼王石達開成了碩果僅存的一個。當年11月，石達開被洪秀全召回天京，在奉命追繳韋昌輝的餘黨時，石達開表現得仁義、寬厚。他下令只對那些罪大惡極的首犯進行嚴懲，被迫參與的韋昌輝部下則不予治罪。對於韋昌輝的親眷，石達開也保護有加，不讓他們受到任何牽連。在石達開的努力下，天京的局勢很快就平定下來了。
在天京事變發生的過程中，清軍在與太平軍的交戰中逐漸佔據了上風。石達開回京後，便指揮太平軍先將局面穩定下來，再尋找機會對清軍發動反攻。除此之外，石達開還提拔了陳玉成、李秀成等年輕將領，這些將領成了後期太平天國運動的中堅力量。
石達開所做的這些努力讓他在太平天國的軍民之中贏得了極高的聲望，洪秀全因此對他產生了很深的猜忌之心，不再對他予以重用。這段時期，洪秀全開始重用自己的族弟洪仁玕。洪仁玕是太平天國後期的主要領導者，《資政新篇》就是由他提出的一套改革方案。
隨著洪秀全對自己的猜忌愈演愈烈，甚至動了殺機，石達開終於走投無路，帶兵出走，避開天王，希望通過這樣的方式避免天京事變在朝中重蹈覆轍。在此之後，石達開率領太平軍在浙江、福建等地先後取得了多次勝利，為太平天國運動的發展立下了不小的功勞。然而，從1859年開始，石達開便在與清軍的對抗中佔了下風。1863年5月，在大渡河一戰中，石達開部被清軍擊敗，兩千名太平軍將士被清軍殲滅，主帥石達開也被生擒，後被凌遲處死。
早在天京事變平定之初，天京就再度遭到了清軍的圍困。由於自身的力量已遭到了嚴重的削弱，太平軍便開始與捻軍合作，並將長江以北的饑民編入太平軍，以壯大太平軍的力量，與清軍抗衡。1858年8月，陳玉成和李秀成共同領導太平軍擊破了駐守在天京以北的江北大營。兩個月後，又在廬州的三河鎮一戰中擊潰了湘軍的一支精兵。這兩次戰役的勝利，成功粉碎了清政府想要攻破天京，進而粉碎太平天國運動的企圖。
局勢平定下來以後，洪仁玕便在洪秀全的支持下提出了《資政新篇》。這是由中國人提出的最早的帶有資本主義色彩的改革方案，其核心是向西方國家學習，在政治、經濟、文化方面進行一系列改革。《資政新篇》的提出就是為了振興太平天國，但是《資政新篇》問世之後，卻沒有真正實施過，原因就是它不是農民階級革命鬥爭的產物，其內容根本就不涉及農民最關注的土地問題，因此它在調動農民革命和生產的積極性方面起不到任何作用，再加上當時局勢動盪，根本就不可能被付諸實踐。
太平天國安定了沒多久，便再度開始了與清軍的交戰。1859年底，清軍的江南大營捲土重來，圍困了天京。第二年3月，太平軍將江南大營擊破，解除了天京之困。隨後，太平軍乘勝追擊，決定先東進，然後再西上。太平軍很快就攻陷了常州、蘇州和嘉興，並建立了蘇福省，以蘇州為省會，使其成為天京在東南方向的壁壘，並向天京提供物資供應。這一年，也就是1860年，是太平天國運動發展到後期，戰績最為輝煌的一年。
同年冬，陳玉成和李秀成再度出兵，兵分兩路進入武昌。由於當時英國海軍出兵幫助清軍，讓陳玉成心生顧忌，遂改變計劃，放棄武昌，轉而向麻城等地發起了進攻。此時，李秀成也退出了湖北，轉戰至浙江。1861年7月，曾國藩率領的湘軍攻陷了安慶，並以此為根據地開始進攻天京。安慶失守後，陳玉成率領太平軍退到廬州，孤立無援。第二年4月，陳玉成被俘，隨後被處死。
1862年，曾國藩命令部下兵分三路，李鴻章率軍趕赴上海，曾國荃前去進攻天京，左宗棠則奔赴浙江。在天京受到曾國荃率領的湘軍圍困後，洪秀全隨即下令召回上海的太平軍，江蘇、浙江兩地的太平軍主力被迫返回天京，清政府乘機聯合西方列強對當地的太平軍發起了猛攻。一方面要抵抗清軍，另外一方面還要抵擋列強的洋槍火炮，這段時期的太平軍處境異常艱難。
當時，李秀成奉洪秀全的命令率軍北上，結果在安徽北部糧草斷絕，與此同時，清軍一路高歌猛進，先後攻下了太倉、昆山、富陽、蘇州等地。在這種情況下，李秀成向洪秀全提議放棄天京，以保全太平天國的實力，但洪秀全卻固執己見，無論如何都要守住天京。1863年11月，洪秀全命令洪仁玕到丹陽等地召集當地的太平軍趕赴天京。1864年初，天京陷入了清軍的包圍圈，城內糧食短缺，兵力不足。當年6月，洪秀全因病去世，其子即位為天王。7月，清軍攻破了天京，李秀成帶著幼天王出逃，卻在逃亡途中與幼天王走散。7月22日，李秀成被俘，數日之後被處死。10月，清軍在江西捕獲了幼天王，並將其處死。太平天國運動就此宣告失敗
。此後，太平軍將領譚體元在長江南岸率領太平軍餘部堅持與清軍作戰，直到1866年才被徹底殲滅。同時，賴文光率領長江北岸的太平軍餘部加入捻軍，直到1868年才隨著捻軍起義的失敗而覆滅。1869年，左宗棠在陝西北部殲滅了袁大魁率領的起義軍，這也是最後一支使用天平天國年號的起義軍。
從1851年到1864年，太平天國運動總共延續了14年。作為一次反帝反封建的農民運動，太平天國運動是我國歷史上規模最大、人數最多、持續時間最長的一次農民起義，給清政府帶來了沉重的打擊，在其影響下，全國各地的人民紛紛發動起義，反抗腐朽的封建統治。