1856年，太平軍繼西征戰場轉敗為勝之後，又先後攻破了威逼天京數年之久的江北、江南大營，太平天國革命再次出現了有利的形勢。可是，與此同時，太平天國領導集團的內部危機日益加深，洪秀全與楊秀清之間，楊秀清與韋昌輝、石達開之間的矛盾越來越表面化，終於在當年秋天發生了可悲的天京內訌。這是太平天國戰爭史上最大的轉捩點。
總攬宗教、政治、軍事三權於一身的楊秀清，成了太平天國領導集團之間各種矛盾的焦點。他有出色的政治和軍事才能，但「自恃功高，一切專擅」，以致天王洪秀全「徒存其名」。１太平軍一破江北、江南大營之後，楊秀清先則將北、翼、燕諸王立即分派離京，繼則假托「天父神旨」，公然逼迫洪秀全封他為「萬歲」２。洪秀全迫於楊秀清的權勢，當面應允，暗中則採取措施，伺機剷除楊秀清。
當時，北王韋昌輝在江西戰場，翼王石達開在湖北戰場，燕王秦日綱在丹陽前線。9月1日夜，韋昌輝率三千餘人從江西秘密趕回天京，隨即對東王府發動突然襲擊，於次日晨將楊秀清及其家屬、近臣全部殺害。接著，韋昌輝又對楊秀清的部屬進行了大屠殺，太平軍將士和群眾二萬餘人罹難，在天京造成了嚴重的恐怖。10月初（一說9月中旬），石達開從湖北趕回天京，責備韋昌輝濫殺無辜。不料韋昌輝又想加害於他，石達開便連夜逃出天京，其家屬則被韋昌輝全部殺害。於是，石達開從安徽、湖北等地調集四萬大軍，集中於安徽蕪湖、寧國府（今宣城）一帶，準備回京討韋。
韋昌輝的大規模屠殺和擅專朝政，激起了天京內外太平軍將士和群眾的極大憤慨。在此情況下，洪秀全下詔將韋昌輝處死，同時被殺的還有參與大屠殺的燕王秦日綱等約二百人。事後，洪秀全派人將韋昌輝等人的首級送安徽寧國府交石達開驗看，並召其回京輔政。約11月底，石達開回到天京，延續兩個多月的天京內訌，至此暫時告一段落。
石達開是東、西、南、北、翼五王中的僅存者，加之智勇兼備，在太平軍中夙有聲望，並為清軍將領（包括曾國藩）所畏憚。因此，由他輔政，受到天京軍民的擁護和歡迎。但是，內訌的陰雲並未因此消散。洪秀全從天京大變亂中錯誤地汲取教訓，自此之後，他只信任洪姓族人，排斥異姓。他在委託石達開輔政後不久，又加封其長兄洪仁發為安王，次兄洪仁達為福王，並讓他倆與石達開同主朝政，以牽制和監視石達開，最後並有圖害之意１。石達開既無法施展其才能，更害怕遭到與楊秀清相同的命運，便於1857年5月底離京出走。
石達開被迫出走，實際上是天京內訌的繼續。由於天京內訌和石達開從天京及其它地區帶走大量部隊，太平天國的元氣大傷，整個戰爭形勢也隨之急劇逆轉。
在江蘇戰場，江南大營的擊破和向榮的死去，曾使清軍遭到沉重打擊。但由於天京內訌，給了敵人以重整旗鼓的機會。1857年7月16日，清軍攻陷句容， 12月27日又攻陷鎮江和瓜洲，太平軍守將吳如孝逃回天京。1858年1月，清軍恢復江南大營，再次圍困天京。
在湖北戰場，由於石達開東返天京，清軍加緊圍攻武昌。太平軍守將韋志俊因困守已久，又不見援兵到來，加之其兄韋昌輝在天京被處決，喪失了堅守的決心，遂於1856年12月19日放棄武漢。武漢一失，鄂東各州縣隨之不守，太平軍的湖北根據地全部喪失。
在江西戰場，湘軍於1857年10月26日攻陷湖口和梅家洲，被太平軍分割二年多的湘軍內湖與外江水師得以重新會合，這一帶的長江水面又被湘軍控制。1858年5月19日，九江城被新任浙江布政使李續賓所部湘軍攻破。駐守該城近五年的太平軍將領林啟容率部進行了英勇的巷戰，一萬七千名將士全部犧牲。
太平天國雖然處於十分嚴酷的形勢之下，但由於以下種種原因，沒有發展到迅速崩潰的地步。
第一，當時全國仍處在革命高潮之中，北方的捻軍、南方的天地會，以及西南各族人民的起義戰爭，正在蓬勃發展，方興未艾，使得清王朝顧此失彼，忙於招架，客觀上給了太平天國革命以很大的支援。
第二， 1856年10月，英、法等資本主義列強，為了在中國攫取包多的殖民特權，悍然挑起了第二次鴉片戰爭，清政府雖然實行妥協求和政策，但也不得不以很大的注意力和相當一部分兵力去對付外國侵略者，於是相對地減輕了對太平軍的壓力。
第三，石達開雖然離京出走，但他率軍遠征東南各省，吸引了一部分清軍兵力，也在一定程度上減輕了清軍對天京方面的壓力。
第四，活躍在安徽戰場的陳玉成和李秀成所部太平軍，積極進擊，頂住了清軍沿江東下的勢頭。先是李秀成被圍於桐城一帶，勢孤力單，後於1857年1月初與陳玉成在樅陽商定了破敵之策，確定對包圍桐城之敵採取大包抄。1月中旬，陳玉成自寧國渡江北上，占無為、巢縣，轉攻廬江，然後直趨桐城。李秀成也率部出城，與陳玉成部協同，夾攻桐城外圍之敵。2月24日，大敗福建提督秦定三等所部清軍，並乘勝於27日攻克舒城。3月初，太平軍克六安，接著揮師北上，與捻軍勝利會師。捻軍接受太平天國的領導後，在淮河中游向清軍展開積極進攻，牽制和削弱清軍兵力，使陳玉成得以率軍進入湖北，在鄂東地區轉戰經年，阻扼鄂軍東犯，穩住了皖北太平軍根據地。
正是這些客觀條件，使太平天國得以繼續堅持革命戰爭。