顧愷之字長康，晉陵無錫人。父親顧悅之，任尚書左丞。顧愷之博學富有才識，曾撰寫《箏賦》，賦完成後對人說：「我的賦可比嵇康的琴音，不願欣賞者必以為它是後輩之作棄之不顧，但深有見識者必因它不同凡響而珍視。」
桓溫徵召他為大司馬參軍，極為親近。桓溫去世後，顧愷之拜祭他的墓，賦詩說：「山已崩裂海水枯竭，魚鳥何處歸宿。」有人問道：「你如此借重桓公，痛哭之狀可見嗎？」答道：「哭聲像震雷可使山崩，眼淚如河流傾注大海。」
顧愷之性好詼諧戲謔，人多親近他。後為殷仲堪參軍，也非常被寵愛和親近。殷仲堪在荊州，顧愷之曾因度假還鄉，仲堪特用帆船助行，經破塚，遭大風襲擊毀壞了很多東西。他在給仲堪的信中說：「地名叫破塚，的確是破了塚出來的。但行人平安，布帆未損。」返回荊州以後，有人向他問會稽山川的景色，他說：「叢山峻嶺競艷，條條河谷爭流。草木非常茂盛，宛如雲蒸霞蔚。」桓玄為將時常與愷之在仲堪處，共作了語。愷之先說：「火燒平原沒有遺物。」桓玄說：「白布纏根黑旗垂樹。」仲堪說：「投魚深泉放出飛鳥。」接著又作危語。桓玄說：「矛頭淘米劍頭為炊。」仲堪說：「百歲老人攀登枯枝。」有一參軍插言：「盲人騎瞎馬面臨深池。」殷仲堪一隻眼失明，吃驚地說：「這太威逼人了！」因而作罷。顧愷之每當吃甘蔗時，總是從稍至根吃。人怪其所為，他說：「這樣可漸入佳境。」
顧愷之更善於繪畫，運筆特別微妙，謝安非常重視他的畫，認為是自生民以來未有之作。他的人物畫畫成以後，往往歷經數年不點眼睛。有人問是為什麼，他答道：「四體的美與醜，本來和畫的妙處無關，傳神寫照，正在眼睛之中。」他曾經愛一鄰家女子，但挑逗不願從。於是將鄰女的像畫在壁上，用刺針釘其心，鄰女即患心痛病。顧愷之向她表述了這個情由，鄰女才表示依從，於是暗暗拔去刺針使其病癒。顧愷之特別看重嵇康的四言詩，因而為他的詩作畫。他常說：「手揮五弦的動作容易畫，目送歸鴻的神態就難畫了。」每塗畫起人形，時人稱為絕妙。曾經畫裴楷像，面頰上只添了三根毛，觀者便覺精神面貌逼真。又給謝鯤畫像，人在巖洞旁，他說：「此人當置於丘壑之中。」擬畫殷仲堪，因仲堪有眼病，不讓畫。愷之說：「明府不讓畫正因為眼睛，如果明點眼珠，飛白擦過，讓它如輕雲蔽月那樣，豈不是很美嗎？」仲堪便答應了。顧愷之曾將一盒藏畫貼上題字的封條，寄贈桓玄，藏畫都是他非常珍惜的作品。桓玄從盒後啟開，取了藏畫，將盒修好封牢還給他，謊稱未開。他見封題一如寄前，只是不見了藏畫，只說是畫自通神靈，變化出去了，就像人修成仙而升天一樣，對此毫無奇怪的表情。
顧愷之誇耀自己言過其實，少年時與人相互標榜各自的美名，故作戲謔嘲笑。又會詠詩，自稱得到先賢風韻寫作規範。有人請他作洛嬪賦，他說：「為何要作老婢女之聲呢！」晉義熙初年(405)，他任散騎常侍，與謝瞻所在官署毗連，夜晚在月下久坐吟詩，謝瞻往往神色飄逸含糊稱讚，顧愷之經久自吟不倦。謝安將要入睡，令從人代替自己相陪，愷之竟不察覺，自吟到天明才止。他還迷信一些小法術，認為誠心求之便可得到。桓玄曾拿一柳葉騙他說：「這是蟬隱蔽的葉子，取得了它可自隱其身，人不能見。」顧愷之甚喜，用柳葉自蔽，桓玄即在近愷之處便溺，他便相信桓玄沒有看見他。把這柳葉看得珍貴。
早期，顧愷之在桓溫府，常說：「愷之體內癡愚聰慧各半，合而言之，正等於平平。」所以世間傳說他有三絕，即才絕、畫絕、癡絕。享年六十二歲，死於任上，著有文集及《啟蒙記》傳之於世。