光緒皇帝死於誰手？歷史上眾說紛壇，莫衷一是。光緒又為何突然「駕崩」？亦是揣測繁多，難以定論。
1908年（光緒三十四年）11月24日，光緒帝突然「駕崩」。次日，慈禧太后亦病故。
關於光緒之死，稗官野史和民間傳說頗多。一說西太后自知病危，派人送藥把光緒帝毒死；一說是袁世凱見慈禧一病難起，怕老佛爺歸天後自己處境岌岌可危，遂賄賂內宦害死光緒；一說太監李蓮英得悉光緒日記中載有西太后死後將誅袁世凱和他的消息，與慈禧合謀將毒藥投入光緒食物之中致使光緒身亡；也有說光緒病重時未得到及時救治而死。如此等等，不一而足。
近些年來，清宮醫藥檔案整理後，編寫出版了《慈禧光緒醫方選議》。有人依據中國第一歷史檔案館所藏的光緒帝診病記錄——脈案，結合當時的歷史背景和現代中醫學理論，撰文說「光緒自幼痼疾纏身，患有結核病，波及肺、腎及其它器官，還有嚴重的遺精病」。又據光緒親筆所寫《起居注》云：「腰胯左邊疼痛甚重，稍一動轉即牽制滿腰，極痛難忍。」從其死前三四日內及其臨終前的病情看，並無發現突發性中毒或其他傷害的徵象。由此認為光緒帝被毒斃的說法，證據不足。光緒之死，乃虛癆之病日久，最終五臟六腑無處不病，陽散陰涸，陰陽離決。其直接死亡之原因，可能是心肺功能的慢性衰竭，合併急性感染所致。
也有人認為，光緒一生中經過外侮內憂，心情始終不佳。尤其是戊戌變法失敗，他在政治上遭受重大變故，其病情開始加重，出現多種病症，氣血雙虧，身體每況愈下。從28歲（光緒二十四年）起病勢逐漸加劇，至光緒三十三年已臥床不起，行動艱難，其病情已人膏育，心肝腑臟皆損，陰陽俱衰。
結果只活了38歲。據光緒死前脈案記載：「皇上脈息如絲欲絕，肢冷氣陷，二目上翻，神識已迷，牙關緊閉，勢已將脫，謹勉以生脈飲以盡血忱。」光緒臨終前數日的脈案都處於搶救狀態，御醫也使盡了渾身解數，說光緒病危時未得到救治也是不確切的。
然而，有人對上述這一說法不以為然。根據曾任當時清廷內務府三席大臣的增崇之子察存耆回憶，在光緒突然去世前兩天，大夫給光緒請脈時，光緒「還在外屋站著，不過臉上較平日灰白些」，而且自己「就覺得痰盛，叫大夫想法去去痰」，怎麼這樣快就不行了呢？又據察存著保存的父親增崇的家書中，有這樣一段話：「脈案一紙，奉閱可也，據醫士雲，此症不甚重，……其脈案上話語，系由春季所有的病症，均奉旨不准撤，全叫寫上，其實病症不是那樣，要是那樣，人就不能動了……。」可見脈案和病情並不是一回事，完全是由慈禧「臉色」定脈案的緣故。凡給光緒請脈的太醫或外省保薦的醫土，依慈禧臉色行事，已經成了一種風氣。察存耆曾回憶了這樣一段太醫只能以「臉色」行事的例子：有位初學當差的太醫，在慈禧面前對答光緒脈案時，說了句「舒肝順氣」的行話，慈禧竟把臉一沉，說：「誰叫皇帝的肝不舒了？氣兒又怎麼不順了？」嚇得那位太醫連連叩頭認罪。以後誰也不敢應承請脈的差使了。「以後，誰為光緒請脈、下處方，總是『和肝調氣』、『理肺益元』，甚至把肝的病硬挪到肺上去。」
再者，光緒暴卒後的入殮亦有悖常理。據察存耆回憶，一天下午快吃晚飯時辰，清內宮給他父親增崇送來內傳口報的「知會」，說「萬歲爺病重」，請即進宮準備給（光緒帝）料理後事，增崇及兩位在內務部任職的弟弟聞後，頓時呆若木雞，因為前兩天尚未聽說光緒有什麼事，且也未得到皇帝病重的「發抄」（皇帝病重，太醫院要主動抄錄藥方和脈案通報各處，相當現在的報病危），故感到「似是猜疑有人捏造謠言」。待證實光緒確實死亡後，更感死因可疑。因為按清廷規矩，皇帝死了，要傳用專為「請」遺體的「萬年吉祥轎」，而這回卻是悄悄地將光緒屍體移到宮內，沒有用此轎，而且等內務府大臣趕到後，屍體已由太監代為人殮完畢。難怪在內務部供職、與醫士接觸較多的增崇兄弟，對光緒帝突然死亡大惑不解了。